Sterilisasi Alat-Alat Kultur Jaringan Tanaman

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kultur jaringan adalah suatu rangkaian prosedur untuk memelihara dan menumbuhkan sel tanaman (dapat berupa kalus, sel, protoplas) dan organ (batang, akar, embrio) secara aseptik. Aseptik disini berarti bebas dari kontaminasi mikroba.
Kultur jaringan tanaman memerlukan kondisi yang bersih dan steril untuk dapat melanjutkan kelangsungan hidupnya. Kondisi yang steril dapat diciptakan dengan cara sterilisasi, salah satunya sterilisasi alat. Sterilisasi alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman sangat penting untuk pertumbuhan eksplan dalam perkembangbiakkannya.
Sterilisasi merupakan salah satu prosedur dalam kultur jaringan yang digunakan untuk menghilangkan mikroorganisme. Pemeliharaan kebersihan dari penyakit (keaseptikan) atau kondisi steril sangat esensial untuk keberhasilan dalam prosedur kultur jaringan. Keadaan aseptis ini diperlukan untuk semua botol kultur yanga akan digunakan, media kultur, peralatan yang akan digunakan dalam kegiatan penanaman eksplan dan eksplan yang akan dikulturkan itu sendiri.

Alat yang digunakan dalam kultur jaringan tanaman terbuat dari gelas, plastik, kertas dan lain-lain. Setiap alat mempunyai fungsinya masing-masing dalam proses kultur jaringan. Kertas merupakan alat yang paling baik digunakan karena sifatnya tidak mudah retak dan pecah seperti gelas, plastik dan lain-lain. Setiap alat yang digunakan dalam kultur jaringan mempunyai ketahanan terhadap suhu dan tekanan yang tinggi.


B. Tujuan

Tujuan dari praktikum  sterilization of equipment yaitu:
1. Mengetahui alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan
2. Mempelajari cara sterilisasi alat menggunakan autoklaf
3. Mengetahui alat-alat yang harus disterilisasi dalam kegiatan kultur jaringan tanaman.

II. TINJAUAN PUSTAKA

Menurut Suryowinoto (1991) dalam Hendaryono (1994), kultur jaringan merupakan budidaya suatu jaringan tanaman menjadi tanaman kecil yang mempunyai sifat sama dengan induknya. Keuntungan dari kultur jaringan tanaman yaitu mendapatkan tanaman baru dalam jumlah banyak dalam waktu yang relatif singkat, yang mempunyai sifat fisiologi dan morfologi identik dengan induknya.
Menurut Wetherell (1982), Murashige membagi tiga langkah perbanyakan tanaman secara in vitro, yaitu:
1. Langkah I : persiapan eksplan
2. Langkah II : penanaman eksplan
3. Langkah III : pertumbuhan akar
Setiap langkah yang digunakan dalam perbanyakan in vitro dalam kondisi aseptik. Karena alat yang digunakann steril sebelum kegiatan kultur jaringan berjalan. Sterilisation alat bertujuan untuk membebaskan alat dari berbagai mikroba termasuk spora (swaney, 2000).
Semua alat yang digunakan dalam kultur jaringan, harus dalam keadaan steril. Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam seperti pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau dengan pemanasan dalam bacticinerator. Khusus untuk skalpel, gagangnya dapat disterilkan dengan pemanasan, namun mata pisaunya (blade) dapat menjadi tumpul bila dipanaskan dalam temperature tinggi. Oleh karena itu untuk mata pisaunya dianjurkan cara sterilisasi dengan pencelupan dalam alkohol atau larutan kaporit (Anonim, 2009).
Biasanya untuk pengkultur jaringan tanaman profesional menggunakan gelas atau botol baru yang digunakan sebagai wadah media. Gelas atau botol baru selalu dibersihkan menggunakan deterjen khususnya untuk botol yang digunakan untuk memindahkan cairan asam, dan lain-lain. Kemudian, botol dibilas dengan air keran dan kemudian dibilas dengan air steril. Kemudian gelas dikeringkan dalam oven suhu tinggi. Gelas ditutup dengan plastik yang tahan panas dalam suhu tinggi dan dililit dengan karet.

III. BAHAN DAN ALAT

A. Bahan
1. Akuades
2. Deterjen

B. Equipments
1. Botol
2. Plastik
3. kompos
4. Erlenmeyer
5. Karet gelang
6. Timbangan analitik
7. Rak kultur
8. Autoklaf
9. Panci
10. Bunsen
11. Sprayer
12. Pinset
13. Label
14. Tisu
15. Gelas ukur
16. Stirrer
17. Pipet
18. Pengaduk
19. Gelas piala
20. Corong
21. Kertas buram
22. Petridish
23. Laminar Air Flow (LAF)
24. Scalpel and blade
25. Alumunium foil

IV. PROSEDUR KERJA

1. Merendam botol, petridish, pinset dan scalpel dengan deterjen kurang lebih 1 hari dan dibilas dengan air keran kemudian keringkan
2. Menyimpan alat yang sudah bersih di tempat yang bebas debu dan dikeringkan tanpa di lap.
3. Setelah botol kering, menutup botol dengan plastik, petridish dengan kertas dan dililit dengan karet gelang.
4. Meletakkan semua alat dalam autoklaf untuk disterilisasi selama 20 menit pada suhu 121oC-126oC dan pada tekanan 15-20 Psi
5. Menyimpan alat-alal di dalam rak inkubasi

V. HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil

Nama alat : Bottle
Fungsi: menyimpan eksplan dan media

Nama alat : Bunsen burner
Fungsi: mensterilisasi scalpel and blade dan pinset

Nama alat : Petridish
Fungsi: menyimpan eksplan  

Nama alat : Pinset
Fungsi: untuk mengambil eksplan

Nama alat : skalpel and blade
Fungsi: memotong eksplan

Nama alat : Pipet
Fungsi:  mengambil larutan

Nama alat : Plastik
Fungsi: menutup botol kultur

Nama alat : karet gelang
Fungsi: mengikat plastik dan kertas pada saat alat disterilisasi

Nama alat : Tisu
Fungsi: membersihkan alat

Nama alat : Label
Fungsi: menandai botol kultur

Nama alat : Sprayer
Fungsi: menyimpan alkohol

Nama alat : Autoklaf
Fungsi: sterilisasi alat dan media

Nama alat : Timbangan analitik
Fungsi: menimbang bahan

Nama alat : Erlenmeyer
Fungsi: tempat membuat larutan stok

Nama alat : LAF
Fungsi: tempat menanam eksplan

Nama alat : Stirrer
Fungsi: mengaduk larutan

Nama alat : panci
Fungsi: memasak media

Nama alat : gelas ukur
Fungsi: mengukur media

Nama alat : kompor
Fungsi: tempat memasak media dan mensterilisasi media dan alat menggunakan autoklaf

Nama alat : rak inkubasi
Fungsi: tempat menyimpan botol-botol kultur yang steril

Nama alat : gelas piala
Fungsi: tempat mengaduk media

Nama alat : corong
Fungsi: memasukkan media ke dalam botol kultur

Nama alat : Pengaduk
Fungsi: mengaduk media

Nama alat : Kertas buram
Fungsi: membungkus alat kultur yang akan disterilisasi


B. Pembahasan

Permasalahan dalam kegiatan kultur jaringan tanaman yaitu membuat dan menjaga lingkungan dan alat yang digunakan dalam kondisi aseptik. Lingkungan di sekitar kita banyak terdapat spora dari bakteri dan jamur yang berukuran sangat kecil dan ringan sehingga mudah terbang pada aliran udara yang sangat lemah sekalipun. Bila spora ini kontak dengan media kultur maka spora akan tumbuh dengan cepat. Dalam beberapa hari spora akan tumbuh menjadi koloni yang tumbuh lebih cepat dan mematikan jaringan tanaman. Oleh karena itu perlu adanya streilisasi alat dan media agar bebas dari mikroba (Wetherell, 1976).

Botol kultur biasanya kecil potensinya sebagai penyebab kontaminasi, karena selalu diautoklaf dengan media.  Alat gelas lain dapat disterilisasi dengan beberapa cara misalnya ekspos ke radiasi UV, penggunaan larutan desinfektan atau lebih mudah dengan mengautoklaf atau dengan pemanasan dalam oven pada 180 oC selama minimal 3 jam.  Alat–alat plastik seperti polypropylene atau polycarbonate harus disterilisasi dengan autoklaf karena plastik tidak tahan panas kering pada 180 oC.  Wadah plastik dapat digunakan berulangkali karena tahan diautoklaf berulangkali tapi akan menjadi sedikit mengkerut (brittle). Untuk sterilisasi panas kering (dalam oven), peralatan seperti scalpel, gunting dan forsep, petridish, beaker dan lain-lain dapat dibungkus dengan kertas atau aluminium foil terlebih dahulu sebelum diautoklaf (Anonim, 2008).
Alat sterilisasi baik media maupun peralatan yang digunakan untuk proses isolasi dan penanaman eksplan yang sering digunakan adalah autoklaf. Tipe autoklaf yang dapat digunakan untuk sterilisasi ada bermacam-macam mulai dari yang sederhana sampai digital (terprogram). Autoklaf yang sederhana menggunakan sumber uap dari pemanasan air yang ditambahkan ke dalam autoklaf. Pemanasan air dapat menggunakan kompor atau api bunsen. Dengan autoklaf sederhana ini tekanan dan temperatur diatur dengan jumlah panas dari api.
 Menurut Wetherell (1976), dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh oleh uap air yang sangat panas. Untuk mensterilisasi alat-alat dibutuhkan suhu uap air 250 oF (121 oC) dalam waktu 15 menit. Untuk menaikkan suhu yang lebih tinggi dari titik didih tersebut yaitu dengan menaikkan tekanan uap air sampai 3 Kg per cm2.
Permasalahan dalam sterilisasi menggunakan autoklaf yaitu bila tekanan dalam autoklaf diturunkan sampai tekanan udara luar sebelum suhu dari cairan tersebut turun sampai 100 oC, cairan akan mendidih dan meluap dari botol. Oleh karena itu, penurunan tekanan dalam autoklaf harus secara perlahan-lahan dengan menjauhkan dari sumber panas dan dibiarkan dingin selama 15-20 menit. Sebelum membuka autoklaf pastikan tekanan turun sampai 1 Atm (Wetherell, 1976).

Autoklaf mempunyai cara kerja yang hampir sama dengan alat masak pressure cooker karena alat ini merupakan sebuah bejana yang dapat diisi dengan air dan ditutup rapat-rapat. Cara kerja autoklaf adalah sebagai berikut:
1. Mengisi panci luar dengan air kalau dapat dengan akuades untuk menghindarkan pengendapan Ca yang biasa terdapat pada air keran
2. Alat-alat atau media yang akan disterilisasi dimasukkan ke dalam panel dalam. Susun botol-botol tersebut hingga mencapai permukaan panel.
3. Mengatur posisi panci dengan memperhatikan alur tempat saluran uap yang terdapat pada tutup dan lingkaran permukaan panci luar .
4. Tutup dengan erat. (kencangkan pengunci tanpa menggunakan alat)
5. Membiarkan salah satu katup pengeluaran uap dalam keadaan terbuka.
6. Meletakkan autoklaf di atas kompor gas atau pembakar bunsen.
7. Memanaskan sampai air dalam autoklaf mendidih dan uap mulai keluar dari katup pengeluaran uap.
8. Membiarkan uap keluar selama 5 menit (minimal), untuk mengeluarkan udara yang terperangkap dalam autoklaf
9. Tutup katup pengeluaran uap.
10. Mengamati kenaikan temperatur dan tekanan.
11. Setelah tekanan mencapai 15 Psi, api kompor dikecilkan.
12. Jaga keadaan tekanan 15 Psi ini dengan mengatur besar kecilnya api kompor secara manual. Selama sterilisasi jangan meninggalkan autoklaf dan mengerjakan hal lain diruang lain karena tekanan dapat meningkat sampai melewati batas. Keadaan ini berbahaya dan dapat menyebabkan kerusakan alat.
13. Setelah waktu sterilisasi tercapai, matikan api kompor.
14. Uap dikeluarkan sedikit-sedikit dengan mengatur katup pengeluaran uap (buka sedikit-sedikit). Jangan sekali-kali membuka katup dan membiarkan uap keluar sekaligus. Keadaan ini menyebabkan media atau air bubble up
15. Setelah tekanan turun sampai 0, buka pengunci dan keluarkan panci yang berisi alat-alat dan media yang telah steril.
Laminar Air Flow adalah suatu alat yang digunakan dalam persiapan bahan tanaman, penanaman dan pemindahan tanaman dari suatu botol ke botol yang lain dalam kultur in vitro. Alat ini diberi nama Laminar Air Flow, karena mengalirkan udara steril secara terus menerus melewati tempat kerja sehingga tempat kerja bebas dari debu dan spora-spora yang mungkin jatuh ke dalam media pada waktu pelaksanaan penanaman. Aliran udara berasal dari udara ruangan yang ditarik ke dalam alat melalui filter pertama (pre-filter), yang kemudian dialirkan keluar melalui filter yang sangat halus yang disebut HEPA (High efficiency Particulate Air FilterI), dengan menggunakan blower. Pada Laminar Air Flow, terdapat 2 macam filter yaitu (Kantharajah, 2009):
1. Pre-filter, yang menggunakan saringan pertama terhadap debu-debu dan benda-benda yang kasar. Pori-porinya kira-kira 5 mm sehingga efisiensinya dapat mencapai  95 mm untuk objek-objek yang ≥ 5 mm.
2. HEPA filter dengan pori-pori 0.3 mm  dan terdapat pada bidang keluar udara ke arah permukaan tempat kerja.
Pre-filter harus sering dibersihkan dengan vacum cleaner dan sebaiknya diganti 1 tahun sekali. Namun HEPA filter diganti setelah melalui pemeriksaan dengan particulate count atau dengan alat yang disebut magnehelic gauge.
Laminar Air Flow ada yang dilengkapi dengan lampu UV ada juga yang tidak. Pada Laminar Air Flow yang tidak dilengkapi dengan lampu UV, blower harus dijalankan terus menerus walaupun Laminar Air Flow sedang tidak dipergunakan. Hal ini dilakukan untuk menjaga kebersihan ruang kerja di dalam Laminar Air Flow tersebut. Pada Laminar Air Flow yang dilengkapi dengan lampu UV, dianjurkan agar menyalakan lampu UV minimal 30 menit sebelum Laminar Air Flow digunakan. Ketika Laminar Air Flow sedang digunakan, lampu UV harus dimatikan sedangkan blower dijalankan. Blower pada Laminar Air Flow yang dilengkapi dengan lampu UV, hanya dijalankan pada saat laminar air flow sedang digunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow yaitu (Kantharajah, 2009):
1. Lampu alkohol
2. Wadah alkohol: botol/gelas piala ≥ 250 ml.
3. Pinset, skalpel, gunting dan jarum.
4. Petridish steril.
5. Disceting Microscope, bila sedang isolasi meristem.
6. Kertas tisu
7. Sprayer berisi alkohol 70%
Menurut Hendaryono (1994), LAF diletakkan di dalam ruang penabur yaitu ruang yang selalu dalam kondisi steril. Ruang penabur dilengkapi dengan dinding porselen sehingga setiap akan dipergunakan dapat disterilkan dengan menyemprot atau menggosokkan alkohol. Cara kerja dari Laminar Air Flow adalah sebagai berikut:
1. Menyalakan lampu UV minimal 30 menit sebelum Laminar Air Flow digunakan. Hindarkan sinarnya dari badan dan mata.
2. Menyiapkan semua alat-alat steril yang akan dipergunakan. Alat-alat yang dimasukkan ke dalam Laminar Air Flow disemprot terlebih dahulu dengan alkohol 70%
3. Menyemprot meja dan dinding dalam LAF dengan alkohol 70% untuk mensterilkan LAF.
4. Blower  pada LAF dihidupkan untuk menjalankan air flow.
5. Menyalakan lampu dalam LAF.
6. LAF sudah siap untuk digunakan.
Hal-hal  yang perlu diperhatikan dalam menggunakan Laminar Air Flow yaitu:
1. Jangan meletakkan lampu bunsen terlalu dekat dengan filter  dan alkohol untuk merendam peralatan kultur.
2. Jangan menumpuk alat-alat, botol-botol media dan lain-lain benda di depan tempat bekerja sehingga menghalangi aliran udara.
3. Jangan mencelupkan alat tanam dengan nyala api ke dalam alkohol karena tidak  terlihat dengan jelas di tempat yang terang
4. Jangan mendekati lampu bunsen dengan tangan yang baru disemprot alkohol atau spiritus.
5. Bersihkan Laminar Air Flow setelah selesai bekerja. Jangan meninggalkan botol bekas, kapas bekas dan sebagainya di dalam LAF
Alat lain yang sama pentingnya dengan LAF dan autoklaf yaitu stirrer. Stirrer mempunyai bentuk yang bermacam-macam dari yang berukuran kecil hingga yang besar. Alat ini berfungsi untuk mengaduk dengan pemanasan. Cara kerja dari stirrer yaitu sebagai berikut:
1. erlenmeyer yang telah berisi larutan diletakkan di atas stirrer
2. kemudian stirrer magnetic dimasukkan ke dalam erlenmeyer
3. nyalakan dan putar kursor ke arah untuk mengaduk
4. stirrer magnetic akan berputar dan mengaduk larutan agar homogen.
PH meter adalah suatu alat satuan ukur yang menguraikan derajat tingkat kadar keasaman atau kadar alkali dari suatu larutan. Unit pH diukur pada skala 0 sampai 14. Istilah pH berasal dari " p", lambang matematika dari negatif logaritma, dan " H", lambang kimia untuk unsur hidrogen. Definisi yang formal tentang pH adalah negatif logaritma dari aktifitas ion hidrogen (Suwargana, 2008). Dalam kultur jaringan, pH menentukan kelayakan media yang akan digunakan sebagai media tanam. Faktor penting adalah pH yang harus diatur sedemikian rupa sehingga tidak mengganggu fungsi membran sel dan pH dari sitoplasma. Pengaturan pH selain memperhatikan kepentingan fisiologi sel, juga harus mempertimbangkan faktor-faktor (Anonim, 2009):
1. Kelarutan dari garam-garam penyusun media
2. Pengambilan (uptake) dari zat pengatur tumbuh dan garam-garam lain
3. Efisiensi pembekuan agar.
Cara Penggunaan pH meter adalah sebagai berikut (Suwargana, 2008):
1. Kalibrasi.  Sebelum pH meter digunakan, pH meter harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan menggunakan standar pH atau sering disebut buffer pH. Standar pH adalah larutan yang nilai pH-nya telah diketahui pada setiap perubahan suhu. Standar pH merupakan larutan buffer pH (penyangga pH) dimana nilainya relatife konstan dan tidak mudah berubah. Urutan kerja kalibrasi pH meter adalah:
a. Siapkan buffer pH 7 dan buffer pH 4, Buka penutup plastik elektroda
b. Bilas elektroda dengan air DI (De Ionisasi/ air bebas ion) dan keringkan dengan menggunakan kertas tisu
c. Nyalakan pH meter dengan menekan tombol on/off
d. Masukan elektroda kedalam larutan buffer pH 7
e. Tekan tombol CAL dua kali, putar elektroda agar larutan buffer homogeny
f. Biarkan beberapa saat sampai nilai yang tertera di disply tidak berubah
g. Tekan tombol CAL satu kali lagi, dan biarkan tulisan CAL pada disply berhenti berkedip
h. Angkat elektroda dari larutan buffer pH 7, kemudian bilas dengan air DI beberapa kali dan keringkan dengan kertas tisu
i. Masukan elektroda kedalam larutan buffer pH 4
j. Tekan tombol CAL dua kali, putar elektroda agar larutan buffer homogeny
k. Biarkan beberapa saat sampai nilai yang tertera di disply tidak berubah
l. Tekan tombol CAL satu kali lagi, dan biarkan tulisan CAL pada disply berhenti berkedip
m. Angkat elektroda dari larutan buffer pH 4, kemudian bilas dengan air DI beberapa kali dan keringkan dengan kertas tisu
n. Pada layar bagian bawah akan muncul angka 7 dan angka 4 yang menunjukan pH meter tersebut telah dikalibrasi dengan buffer pH 7 dan buffer pH 4
2.   pH meter telah siap digunakan
3.   Pengukuran pH Larutan

VI. SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan

1. Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan steril agar media tanam dapat bebas dari mikroba yang dapat mengganggu pertumbuhan eksplan
2. Sterilisasi alat menggunakan autoklaf selama 15-20 menit pada suhu 121oC-126oC dan tekanan 15-20 Psi
3. Alat-alat yang disterilisasi yaitu glasware (botol kultur) dan dissecting kit (pinset, petridish)

B. Saran

Kegiatan sterilisasi membutuhkan waktu yang lama dan membutuhkan perhatian yang penuh. Alangkah lebih baiknya kompornya tersedia banyak karena banyak praktikan yang berdiam diri dan tidak memperhatikan jalannya sterilisasi.